细胞中过表达外源基因的研究方法自从Waston和Crick发现DNA双螺旋后,生命科学已经从形态描述的阶段发展到基因功能研究的阶段。对基因功能的研究主要集中在基因的表达,基因的突变,所表达蛋白的定位以及不同蛋白之间的相互作用对细胞功能的影响。这些研究所依赖的一个很核心的研究工具就是在细胞中通过过表达外源基因去影响内源基因的功能或者去观察基因突变的功能以及蛋白的定位对细胞功能的变化。 在细胞中过表达外源基因的研究方法主要可以分为以下2种类型: 1、过表达野生型基因:主要通过模拟内源基因的表达上调来观察目的基因功能。这是历史上使用最为广泛的一种研究手段。因为过去研究人员认为许多细胞的基本功能(细胞增值,分裂,凋亡和分化等)主要是因为基因的差异性表达导致的。通过过表达外源野生型目的基因,可以帮助研究人员了解基因的差异性表达如何影响细胞功能。在此基础上,依据基因本身的不同特性(高表达产生细胞毒性或者抑制细胞生长),基因表达的时空特异性,人们开发出了一系列可以特异地在时间和空间上启动基因表达的诱导表达系统和组织特异性表达系统。通过融合不同的标签蛋白,还可以帮助科学家们研究蛋白的亚细胞定位,细胞或组织定位,蛋白的相互作用网络。 2、过表达显性失活(dominant negative)突变或者持续激活 (constitutively active) 突变基因从而达到失活或者激活内源基因的目的 :有一类突变的蛋白质具有显性阻断完整的野生型蛋白质功能的能力,这常常是通过在突变型和野生型之间形成无功能的二聚体或去除限制性辅助因子的作用来实现的,因此过表达此类突变基因可以阻断细胞内内源基因的正常功能。显性失活突变型常在癌症生物学中出现。 有些目的蛋白的活性需要特殊调节,高表达并不能激活此类蛋白。可以对这一类蛋白质进行突变改造使其具有持续的活性并不受内源野生型基因的干扰,过表达此类突变基因可以模拟目的基因的持续激活功能。 过表达系统在历史上对科学家们的帮助巨大,但由于其并不能完全模拟体内基因表达的特征,甚至在很多情况下,例如没有考虑时空特异性表达因素,引入了过多的人为因素(atificial factors)导致一个错误的结论。所以现在更倾向在以下几个方面进行改进: 1), 使用病毒载体,从而在降低外源基因细胞内拷贝数的情况下仍然不影响基因传递效率。 2), 使用稳定表达系统,以排除在一段时间周期内瞬时表达导致的表达量变化对基因功能研究的影响。 3), 使用可控的过表达系统进行基因表达,从而更加真实模拟内源基因表达特征。 |