流式凋亡检测

apoptosis detection

实验原理

细胞凋亡(Cell apoptosis)是指为维持内环境稳定，由基因控制的细胞自主的有序的死亡。细胞凋亡与细胞坏死不同，细胞凋亡不是一件被动的过程，而是主动过程，它涉及一系列基因的激活、表达以及调控等的作用，它并不是病理条件下的损伤，而是为更好地适应生存环境而主动争取的一种死亡过程。

细胞凋亡检测的方法很多，我们采用的Annexin V/PI双染法检测细胞凋亡的原理：磷脂酰丝氨酸(Phosphatidyl serine, PS)正常位于细胞膜的内侧，但在细胞凋亡的早期，PS可从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面，暴露在细胞外环境中。Annexin-V是一种分子量为35~36KD的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，能与PS高亲和力特异性结合。将Annexin-V进行EGFP融合、荧光素(FITC、PE)或biotin标记，以标记了的Annexin-V作为荧光探针。(如下图7.4所示）。

图7.4 Annexinv检测细胞凋亡的原理

碘化丙啶(Propidine lodide,PI)是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但可进入凋亡中晚期的细胞和死细胞，而使细胞核红染。Annexin V/PI　双染法检测细胞凋亡，可以将凋亡早期的细胞和凋亡晚期以及死细胞区分开。

技术应用

细胞凋亡研究不仅受到基础医学界的重视,也日益受到临床医学领域的青睐。通过检测药物、基因或蛋白对细胞凋亡及凋亡调控基因的影响,在肿瘤防治、老年痴呆、艾滋病、自身免疫病,心肌梗塞等研究上都发挥着积极的作用。

实验流程

实验结果展示

图1 采用流式细胞仪Annexin V/PI双染法检测细胞凋亡

TROUBLESHOOTING

常见问题FAQ

Q :常用的细胞凋亡的检测种类有哪些?

A :凋亡检测方法有数十种之多,主要可以分为以下几大类: 1) DNA水平,检测凋亡时基因组DNA的变化; 2)蛋白水平,主要检测凋亡时线粒体和死亡受体两大凋亡通路的变化; 3)细胞膜/细胞器膜水平,主要检测凋亡时细胞膜成分或者膜电位的变化; 4)超微结构,主要检测凋亡时亚细胞结构的变化。这些方法各有优缺点,必须结合具体的实验目的,实验条件以及实验处理来选择合适的分析手段。

Q :常见的细胞凋亡检测方法及优缺点比较?

Q: Annexin V/PI双染实验的四个象限分别代表什么?

A:根据费光情况划分四个象限(见图7.6) ,横坐标代表绿色荧光(Annexin V为FITC绿色荧光标记),纵坐标代表Pl红色荧光,四个象限分别命名为LL, LR, UR, UL,由于Pl不能穿过未凋亡细胞和凋亡早期细胞的细胞膜,而Annexin V可以检测到凋亡早期外翻的PS,因此四个象限代表了不同的细胞群。

图7.6流式四象限图

Q:流式上机检测细胞凋亡每次所需要的细胞量大概是多少?

A:靶细胞接种到6孔板中进行前期药物处理/转染/感染后备用。对于个体比较大的细胞,依据实际细胞密度,使用150pxt培养血培养细胞,最终进行检测需要10^5-10^6个细胞。

参考文献

1. Vermes I, C, Steffens-Nakken H,et al. A novel assay for apoptosis. FIow cytometric detection ofphosphatidylserine expression on early apoptotic cells using fluorescein labelled Annexin V. J Immunol Methods 1995,184(1):39-51.

2. K o o pman G, Reutelingsperger CP, Kuijten GA, et al . Annexin V for flow cytometric of phosphatidylserineexpression on B cells undergoing apoptosis. BIood 1994, 84(5):1415-1420.