腺病毒包装

adenovirus

实验原理

腺病毒是直径约80-120 nm的无包膜的线性双链DNA病毒（见图3.1），可迅速感染分裂和非分裂期细胞，与细胞表面受体结合后通过内吞作用进入细胞，在细胞核孔附近聚集，并在感染后2h将腺病毒的DNA释放到细胞核中并开始蛋白表达。通过对野生腺病毒进行改造，保留包装信号序列，去除病毒蛋白的编码序列，不仅增加外源基因的装载容量，而且降低细胞毒性和机体免疫反应，从而获得安全性更高的基因导入系统。

腺病毒包装系统的特点：不整合到宿主细胞基因组，无插入致突变性；可进行有效扩增，获得高滴度高纯度的腺病毒。

图3.1腺病毒结构示意图

技术应用

体外实验可快速有效地将目的基因或RNAi片段导入靶细胞，研究目的基因功能。

体内实验多应用于疫苗接种、基本治疗研究等。

实验流程

病毒提供规格

载体图谱

　　          图3.2第一次重组腺病毒中间载体图谱　　　           　           　  图3.3第二次重组腺病毒载体图谱

实验结果展示

图3.4过表达腺病毒感染原代大鼠神经元细胞图片及qPCR过表达检测

图3.5腺病毒感染各种细胞图片展示

TROUBLESHOOTING

常见问题 FAQ

Q: 客户提供 RNAi 靶点进行腺病毒包装要注意哪些要点？

A：客户提供的 RNAi 靶点序列，需明确该靶点在靶细胞的 RNAi 效率是否经过客户验证。如果是客户从文献

中查询到的 shRNA 干扰靶点序列，其在靶细胞的干扰效率能否达到客户要求具备一定风险，建议可进行小量

包装验证后再进行大量包装实验。若客户无法提供 RNAi 靶点，建议客户在我公司进行 RNAi 靶点的设计和筛

选工作，将筛选得到的最佳靶点进行腺病毒包装工作。

Q :腺病毒载体对目的基因的长度是否有要求？

A：有要求。一般基因长度超过 3000bp 的基因在载体重组过程中难度已经加大，且会影响腺病毒的出毒效率。

Q:腺病毒发货前进行哪些质检工作？

A：发货前我们会对腺病毒的滴度进行检测，采用的方法为 TCID50 方法（单位为 TCID50/ml），严格按照客户的要求的滴度进行发货；对于过表达目的基因的腺病毒，我们会将其感染 293 细胞，qPCR 检测过表达目的

基因的表达丰度。

Q : TCID50 法检测腺病毒滴度的操作过程及周期？

A：96 孔板中接种 293 细胞后，用 DMEM 将病毒液稀释成 8 个浓度（如 10-3-10-10），每个浓度重复 10 孔，每孔加入病毒稀释液 100μl，37℃培养 10 天，观察细胞，根据细胞病变率计算滴度值。注意滴度检测操作时间长, 需要感染病毒后 10 天才能观察和计算结果 , 需客户耐心等待准确的滴度测定结果。

Q:腺病毒的单位 VP、PFU 和 IU 各是何含义？

A：VP：病毒颗粒数（viral particle），是具备感染能力和不具备感染能力的腺病毒颗粒的总量。

PFU：空斑形成单位（plaque formation unit），是有感染能力的腺病毒的总量，即腺病毒的活性单位。

IU：感染单位（infectious unit），是腺病毒活性单位，测定方法是TCID50法。

Q : 订制的腺病毒产品接收后如何保存和使用？

A：我们采用干冰特快专递方式递送到客户手中。客户收到后，应注意以下几点：

1）确认泡沫塑料盒中的干冰仍有剩余，冰盒内保持低温；2）确认泡沫塑料盒内物品与发货样本清单一致，腺病毒产品包装完整，没有破碎、渗漏；3）公司提供分装好的腺病毒产品，短时间内不使用请冻存于 -80℃超低温冰箱中。半年内使用完毕。4）冻存于 -80℃超低温冰箱中的腺病毒产品使用前取出,后在室温下解冻，解冻后放在冰浴中，并尽快使用。如果解冻后的病毒暂时用不完，滴度足够高时（比如 1011~12TCID50/ml），4℃可保存 1~2 周。5)若每次用量很少，可对腺病毒进行分装。

Q 包装好的病毒在使用中要注意哪些安全性问题？

A：腺病毒的使用要求在生物安全标准 2 级 (BL2) 的实验室进行，操作人员穿工作服、戴口罩及一次性乳胶手套。操作时应在指定的区域内使用 II 级生物安全柜；操作时动作尽量轻柔，避免产生气溶胶和飞溅；含有腺病毒的废液和用具可用 121℃高压灭菌 30 分钟；使用锐器（如注射器、刀片）时务必要小心。

Q : 腺病毒可以浓缩或稀释吗？方法如何？

A：可以浓缩：浓缩后的滴度以不超过 3×1012v.p/ml 为宜，过浓可能导致病毒聚集而产生沉淀。可以稀释：可采用PBS、生理盐水、DMEM等进行稀释，稀释后的样品尽量一次用完，在没有保护剂的情况下，腺病毒在 2 ～ 8℃保存时间不能超过一周。

Q :用于体内试验的腺病毒，是否要求纯化？

A：体内实验腺病毒纯化是很必要的：因为细胞裂解液包含有缺损颗粒、大量的腺病毒 fiber 和 penton 蛋白（细胞毒素）、培养基、血清以及细胞碎片。这些杂质如果被注入动物体内，会引起宿主强烈的免疫反应。另外，纯化的作用还可以将病毒浓缩至一定浓度便于注射、使病毒悬浮于适于体内注射的缓冲液中。

Q :小鼠体内注射腺病毒，一只小鼠大概需要多少量？腺病毒对小鼠的半数致死剂量（LD50）大概是多少？

A：我们建议的腺病毒用量范围在 108-10IU/ 只小鼠，客户需进行预实验摸索正确的使用剂量。小鼠肌注腺病毒后，3~4 天目的蛋白的表达达到高峰，一周后逐渐下降，持续表达时间在两周左右。静脉注射小鼠（昆明鼠），半数致死剂量 LD50 大约为 1×1011v.p./ 只；裸鼠和 SCID 鼠（严重联合免疫缺陷小鼠）可能更敏感一些。肌注方式的 LD50 未测到：1×1012v.p./ 只给药，未发现小鼠死亡。

Q :可以更换特异性启动子后进行腺病毒包装吗？

A：可以。常规采用 CMV 启动子可以获得理想的表达，若需要采用特异性启动子进行腺病毒包装，建议验证该启动子介导的表达效率后，再进行腺病毒特异性启动子载体的构建及包装工作。

参考文献

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2.Russell, W. C. (2000). Update on Adenovirus and its Vectors. J. Gen. Virol. 81, 2573-2604.

3.Wang, I. I., and Huang, I. I. (2000). Adenovirus Technology for Gene Manipulation and Functional Studies. Drug

Discovery Today 5, 10-16.