产品简介：

• 细胞凋亡普遍存在于生物界，是细胞的基本特征之一，对胚胎发育及形态发生、组织修复、内环境的稳定、机体的防御和免疫反应等方面都起到十分重要的作用。

• AnnexinV-RFP细胞凋亡检测试剂盒(Annexin V-RFP Apoptosis Detection Kit)是用RFP融合的重组人AnnexinV来检测细胞凋亡时出现在细胞膜表面的磷酯酰丝氨酸的一种细胞凋亡检测试剂盒。可以使用流式细胞仪、荧光显微镜或其它荧光检测设备进行检测。AnnexinV是一种分子量为35.8kD的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，广泛分布于真核细胞胞浆内，参与细胞信号转导。AnnexinV 能与磷酯酰丝氨酸(phosphatidylserine，简称PS)高亲和性特异地结合。在正常细胞中，PS主要分布在细胞膜内侧，在细胞发生凋亡的早期，细胞膜上的PS会外翻到细胞表面。用带有红色荧光的AnnexinV-RFP标识出凋亡细胞。

• 本试剂盒检测的是红色荧光，因此在待检测的细胞已经表达GFP等绿色荧光蛋白的情况下，特别适合使用本试剂盒检测细胞凋亡。

产品包装：

保存条件：

4℃保存，AnnexinV-RFP 染色液需避光保存，半年有效。若长期保存，结合液可以-20℃保存。

需自备的试剂及仪器：

• PBS

• 蒸馏水或去离子水水平离心机

• 流式细胞仪或荧光显微镜移液器

使用说明：

A.样品准备

1A.对于悬浮细胞，在进行完细胞凋亡刺激后，1000g离心 5分钟。

1B.对于贴壁细胞，把细胞培养液吸出至合适离心管内（内含已经悬浮的发生凋亡或坏

死的细胞），PBS 洗涤贴壁细胞一次，加入适量胰酶消化细胞。室温孵育至轻轻吹

打可以使细胞吹打下来时，吸除胰酶，避免胰酶消化不够或消化过度。加入收集的

细胞培养液，轻轻吹打均匀，转移到离心管内，1000g 离心 5 分钟。

注意：中晚期凋亡细胞因失去贴壁能力而悬浮于上清中，此部分细胞对于结果是否显著具有重大影响，不可任意丢弃，需离心收集后一起检测才能全面反映出细胞凋亡的整体情况。

注意：胰酶消化时细胞处理需要小心操作,尽量避免人为的损伤细胞。

2.弃上清，用 1ml PBS 轻轻重悬细胞并计数（不少于105），然后 1000g 离心5 分钟收集细胞。

注意：PBS 洗涤细胞，洗掉残留的胰酶，否则残留的胰酶会消化并降解 Annexin V-

RFP，最终导致染色失败。

3.加入 400μl1×Binding Buffer 轻轻重悬细胞。

4.加入 5μlAnnexin V-RFP，轻轻混匀，室温避光孵育 15 分钟。

5.在 30 分钟内进行流式细胞仪检测，AnnexinV-RFP 为红色荧光。

6.如果用荧光显微镜下检测，则 1000g 离心5 分钟，收集细胞，用 50-100μl 1×Binding Buffer 轻轻重悬细胞，涂片后，荧光显微镜下观察。

B.流式细胞仪分析

• 流式细胞仪激发光采用激发波长 545nm，发射波长>575 nm 检测RFP。Annexin V-RFP的红色荧光通过RFP 通道（FL2）检测。细胞应可分成三个亚群：正常活细胞仅有很低的荧光强度，凋亡和坏死细胞有较强的红色荧光。如果要进一步区分凋亡和坏死细胞，可以使用其他细胞凋亡检测试剂盒进行检测。

• 使用流式细胞仪正确分析 Annexin V-RFP 染色的细胞前要求仪器的荧光补偿来去除两种染料激发光之间的叠加，不同仪器之间的补偿不同。因此需要设置未处理细胞空白对照和经 Annexin V-RFP 单染的细胞、本身表达其他荧光（如GFP）的 3 个对照样本来调整荧光补偿去除光谱重叠。根据对上述 3 个对照的分析设定十字门的位置。补偿样品上机及调整细则如下：

1. 上样未经染色的细胞，在线性 FS-SS 点图上显示细胞并设门圈出目标细胞群体，选定有效事件区域。建立FL1-FL2 双参数点图并分析以上散点图中设门的细胞，保证>98%的细胞处于在X、Y轴Log1 为边界的左下象限中心区域。

2. 检测 Annexin V-RFP 单染的细胞并检查FL1-FL2 散点图，保证在左上和右上象限内没有颗粒。如果有颗粒出现在上端象限则说明有荧光渗漏；需降低 FL1PMT 的电压，以有效地去除FL2 的阳性信号。

3. 检测仅表达如 GFP 荧光的细胞并检查 FL1-FL2 散点图，保证在右上和右下象限内没有颗粒。如果有颗粒出现在右侧象限则说明有荧光渗漏，需降低FL2 PMT 的电压，以有效地去除 FL2 的阳性信号。

4. 如果在以上调节补偿过程中更改了 PMT 的电压，建议重复2、3步骤。

注意事项：

• 该试剂盒只能检测活细胞，而不能用于切片、擦刮、固定或浸润细胞样品的检测。细胞凋亡是一种持续变化的动态过程，选择合适的诱导时间对观察凋亡比较重要。

• 染色后宜尽快检测，时间过长可能会导致凋亡或坏死细胞的数量增加。如果有细菌或真菌污染，会严重影响检测效果。

• PBS洗涤细胞，洗掉残留的胰酶，否则残留的胰酶会消化并降解Annexin V-RFP，最终导致染色失败。

• 荧光物质均易发生淬灭，在进行荧光观察时，尽量缩短观察时间，同时在操作和存放过程中也尽量注意避光保存。

• 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

• 检测血液样品时，如果含有血小板，请使用含有 EDTA 的缓冲剂并 200×g 离心洗去血小板。因为血小板含有 PS，能与 Annexin V 结合，从而干扰实验结果。旋盖离心管装的试剂在开盖前请短暂离心，避免开盖时液体洒落。

• AnnexinV-RFP是光敏物质，在操作时请注意避光。